撰文 | 徐颖

责编 | 酶美

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种获得性免疫防御系统：入侵者进入宿主细菌后，其基因被加工成间隔序列（spacer）储存在CRISPR重复序列之间形成免疫记忆；当其再次侵入时，原核生物的效应复合体迅速响应，识别外源序列并使其失活（图1）。CRISPR-Cas效应复合体由Cas蛋白（CRISPR-associated protein）组成，能够与crRNA结合。外源核酸片段整合到基因组上后，可以在CRISPR位点启动子的控制下进行转录，合成包含一系列重复序列及间隔序列的RNA分子，即前体CRISPR RNA（pre-crRNA）。随后，细菌内cas蛋白将其进一步加工，在CRISPR重复序列的特定位点进行剪切，从而形成的由重复序列和一个间隔序列组成的CRISPR RNA，简称为crRNA。crRNA与外源靶标核酸能够互补结合，当检测到入侵者的痕迹时，启动免疫反应。

图1. CRISPR-Cas适应性免疫。（A）适应：Cas1-Cas2复合体获得外源性片段，并将其整合到CRISPR基因簇中；（B）表达：CRISPR基因簇经过翻译和加工形成crRNA，其相关Cas蛋白，即Cas效应核酸酶表达，而后二者经过加工和组装形成一个核糖核酸复合体——监控复合体；（C）干扰：效应核酸酶通过crRNA与外源核酸互补配对，使外源片段降解【1】。

III型CRISPR-Cas免疫在原核生物中广泛存在，通常由多亚基效应复合物介导。近期，一种类似III型系统的新的CRISPR-Cas亚型被生物信息学预测并归类为III-E型。典型的III型系统的效应蛋白由多个蛋白亚基构成，而III-E型的效应蛋白是由多个重复相关的神秘蛋白（repeat associated mysterious protein，RAMP）结构域融合而成，因此又称之为gRAMP（giant RAMP）。gRAMP具有1300-1900个氨基酸，是迄今为止发现的最大的单亚基效应蛋白。TPR-CHAT（tetratrico-peptide repeat，TPR）预测是来自caspase家族的蛋白酶，其成员通常催化靶蛋白中特定肽键的水解，是一种caspase-like肽酶，其功能还有待鉴定。

2021年8月27日，荷兰代尔夫特理工大学（Delft University of Technology）Stan J. J. Brouns团队在Science杂志上发表文章 The gRAMP CRISPR-Cas effector is an RNA endonuclease complexed with a caspase-like peptidase，揭示来自厌氧氨氧化菌（Candidatus "Scalindua brodae"）的III-E型效应蛋白（简称Sb-gRAMP），是一种能与TPR-CHAT形成复合体的核糖核酸内切酶，它可能通过靶标RNA激活TPR-CHAT肽酶的蛋白酶活性获得病毒免疫。

研究人员发现插入III-E型CRISPR基因簇的间隔序列偏好靶向开放阅读框的编码链，表明gRAMP活性可能与入侵者的mRNA相互作用。一些III-E型基因座携带与逆转录酶融合的Cas1，暗示III-E型获得机制可能是从RNA中获取间隔序列。

但奇怪的是，gRAMP基因簇缺乏辅助核酸酶基因，却经常与编码TPR-CHAT蛋白的基因共同出现。因此研究人员推测caspase家族与CRISPR-Cas系统III-E型的抗病毒活性存在一定的功能关系，并在本研究中进行验证。

研究人员用大肠杆菌系统共表达了Sb-gRAMP和crRNA（含5个间隔序列），通过Strep亲和层析、肝素亲和层析和凝胶阻滞层析（SEC）获得高纯度的Sb-gRAMP-crRNA复合物。多角度光散射（MALS）分析表明得到的复合物是由一个Sb-gRAMP单体与44-60 nt的ssRNA结合形成的。

“Scalindua brodae” III-E型基因座包含一个CRISPR基因簇，后者由36nt的重复序列和11个间隔序列组成。为了进一步分析成熟crRNA的特征，研究人员通过PCR扩增、RNA提取和RNAseq等实验证明该RNA包含一个27-28nt长的5’-手柄，其末端具有14nt保守的重复序列，大多数成熟crRNA被切割。研究人员发现Sb-gRAMP能够结合带有不同拷贝间隔序列的crRNA，并且其中缺乏参与pre-crRNA加工的基因，因此推测Sb-gRAMP可能类似Cas12和Cas13，能够自行加工pre-crRNA。

Sb-gRAMP能够识别靶标RNA，并在相距6nt的两个特定位点对单链RNA进行切割，对ssDNA或非互补ssRNA无切割活性。因此，研究人员认为Sb-gRAMP是一种序列和位置特异性的crRNA指导的核糖核酸内切酶，其RNase活性依赖于金属离子。

由于四肽重复序列（TPR）结构域通常参与蛋白-蛋白的相互作用以及蛋白复合物的形成。因此研究人员在细胞内共表达带有不同融合标签的TPR-CHAT和和Sb-gRAMP-crRNA，并互为钓饵，结合MALS实验结果，发现Sb-gRAMP-crRNA能够和TPR-CHAT以1:1的比例结合形成稳定的复合体，并将这一复杂的复合体命名为Craspase（CRISPR-guided Caspase）。

III-E型gRAMP效应蛋白既具有I类CRISPR-Cas系统的特征（多个结构域，6nt切割间距，PFS和RNA切割位点相互独立），也具有II类CRISPR-Cas系统的特征（效应蛋白为单一蛋白），模糊了传统的CRISPR-Cas系统分类。尽管gRAMP-crRNA具有特异性切割RNA的能力，能够有助于抗病毒防御，但在III-E型CRISPR-Cas系统中靶标RNA识别和切割的主要作用是充当Caspase的开关。

在其他III型CRISPR-Cas系统中，RNA靶向作用可以调节第二信使的产生，从而调控辅助核酸酶的活性。然而，该研究发现Sb-gRAMP-crRNA靶向RNA，并与TPR-CHAT形成稳定的复合物产生一个模型，其中Sb-gRAMP-crRNA并不是使用第二信使，而是在靶标RNA识别时变构诱导肽酶活性，从而引发特定的免疫反应。

原文链接：

https://science.sciencemag.org/content/early/2021/08/25/science.abk2718

参考文献

1. Gavin J. Knott,Jennifer A. Doudna. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. DOI: 10.1126/science.aat5011

来源：BioArt